SEKK - Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi 2012
Prosíme, věnujte u každého dokumentu pozornost datu jeho poslední aktualizace, které je uvedeno v zápatí (obsah dokumentu vždy odpovídá stavu poznání v době jeho vzniku).
 

HLA typizace

Na povrchu všech lidských buněk jsou exprimovány molekuly, které jsou rozeznávány imunitním systémem jiného jedince jako cizí antigeny. Kromě antigenů charakterizujících krevní skupiny jsou to dále zejména HLA (human leukocyte antigens) antigeny, které maji zásadní význam při transplantacích některých buněk či orgánů. Hlavní komplex tkáňové slučitelnosti (major histocompatibility complex - MHC), který je u člověka označován jako HLA komplex, se nachází na krátkém ramínku šestého chromozomu a má tři oblasti (regiony). V první a druhé oblasti jsou geny kódující HLA antigeny první a druhé třídy, zatímco v třetím regionu se nacházejí geny komplementu, tumor nekrotizujícího faktoru (TNFalfa) a další geny, které jsou strukturálně a funkčně odlišné od HLA genů.

 

Existuje šest hlavních (klasických) HLA lokusů: HLA-A, B, a C (I. třída) a HLA-DR, DQ a DP (II. třída). Geny (lokusy) kódují HLA antigeny, které patří do „nadrodiny“ imunoglobulinů a mají analogickou strukturu. Geny HLA jsou velmi variabilní (polymorfní), vlastně nejrozmanitější v lidském genomu. Různé varianty genů, určující sekvenci aminokyselin jednotlivých HLA antigenů, se nazývají alely. Do konce roku 2005 bylo evidováno 720 alelních variant HLA-B, 420 alel HLA-A a více než 500 alelních variant genu HLA-DRB1, přitom jejich počet neustále roste. Každý antigen má číslo, např. HLA-A1, A2, A3, A10 atd. Geny HLA se dědí jako celá sada, neboli haplotyp. Protože každý jedinec má dvě sady chromozomů, jedna sada pochází od matky a druhá od otce. HLA alely mají kodominantní expresi, to znamená, že není-li přítomna genetická porucha, dochází vždy k expresi obou alel. HLA geny jsou ve vazebné nerovnováze (linkage disequilibrium), tj. určité kombinace alel se dědí často společně (jako haplotyp, např. HLA-A1, B8, DR3), a mají nízkou frekvenci rekombinace.

 

Principy nomenklatury HLA

 

Název

Označuje

HLA

HLA oblast, nebo předpona pro HLA gen

HLA-DRB1

určitý HLA gen, t.j. DRB1

HLA-DRB1*13

skupina alel, která kóduje antigen DR13

HLA-DRB1*1301

určitá HLA alela

HLA-DRB1*1301N

alela, která není exprimována

HLA-DRB1*1301102

alela, která obsahuje mutaci mimo kódující oblast

HLA-DRB1*1301102N

neexprimována alela, která obsahuje mutaci mimo kódující oblast


Geny se označují písmeny z latinské abecedy - např. HLA-DRB, HLA-DQA, zatímco polypeptidové řetězce, které jsou jimi kódovány, řeckými symboly - např. HLA-DRb, HLA-DQa. Typizace HLA antigenů pomocí typizačních sér (aloantisér) určuje jednotlivé antigeny na povrchu lymfocytů, např. HLA-A2 nebo HLA-B44. Typizace DNA metodikou určuje alely (varianty genů), které definují daný antigen. Pokud za názvem lokusu následuje hvězdička (*), znamená to, že HLA typizace byla provedena DNA metodikou.

 

Antigeny I. třídy (HLA-A, -B, -C) se vyskytují prakticky na všech jaderných buňkách, i když se jejich exprese v různých tkáních výrazně liší (104 až 106 antigenů na povrchu buňky). Antigeny II. třídy (HLA-DR, -DQ a -DP) se vyskytují jen na antigen-prezentujících buňkách (makrofágy, B-buňky, dendritické buňky, aktivované T buňky a epiteliální buňky v thymu) a s tím souvisí i jejich důležitá role v imunitní odpovědi. V některých případech může být indukována exprese antigenů II. třídy i na buňkách, které za normálních okolností antigeny II. třídy neexprimují, např. při akutní celulární rejekci je vlivem interferonu-gama indukována exprese DR antigenů na tubulárních buňkách ledvinového štěpu.

 

 

Metody typizace HLA antigenů

Typizace HLA má v transplantační medicíně stále důležité postavení. I přes velký pokrok v imunosupresivní terapii, shoda v HLA antigenech má jednoznačně příznivý vliv na dlouhodobé přežití transplantovaných orgánů. Na rozdíl od orgánových transplantací, kde jsou v praxi běžné neshody mezi dárcem a příjemcem ve dvou i více HLA antigenech, pro transplantaci kmenových buněk (kostní dřeně) je nutná mnohem přísnější shoda. Většinou transplantační centra provádějící transplantace kostní dřeně připouští jen jedna neshoda na úrovni alel v hlavních lokusech HLA-A, B a DR.

 

Sérologická typizace HLA antigenů je i přes své nevýhody  rutinně používána v HLA laboratořích na celém světě. Důvodem jsou poměrně nízké náklady a dostačující úroveň rozlišení pro transplantační program orgánů. Lymfocyty jsou inkubovány na Terasakiho destičkách s typizačními séry (polyklonálními nebo monoklonálními) a potom s králičím komplementem. Pozitivní reakce (aktivace komplementu a nález mrtvých buněk) znamená, že je na povrchu buněk určitý HLA antigen, proti kterému jsou namířeny protilátky v typizačním séru. Odečet živých /nebo mrtvých buněk se provádí po přidání barvy (eozin) ve fázovém kontrastu nebo fluorescenčním mikroskopem. Nevýhody sérologie spočívají hlavně v nezbytnosti použití živých lymfocytů, v omezené úrovni rozlišitelnosti a ve skutečnosti, že typizační séra se musí pravidelně vyhledávat zdlouhavým screeningem tisíců sér.

 

Molekulárně-biologické typizační techniky mají kromě flexibility rozlišení lepší reprodukovatelnost a přesnost než klasické sérologické metodiky. Nerozšířenější využití mají metodiky založené na principu PCR reakce (polymerase chain reaction) za využití sekvenčně-specifických primerů PCR-SSP (sequence-specific primers) a sekvenčně specifických sond - PCR-SSOP (sequence-specific oligonucleotide probes). Sekvenování (sequencing-based typing, SBT) pro HLA typizaci má zatím omezenou aplikaci především pro charakterizaci nových alel a pro vyřešení nejednoznačných typizačních výsledků na úrovni „high resolution“. Podrobnější popis DNA metodik je snadno dosažitelný v literatuře a je mimo rámec této kapitoly V současné době nejnovější metodou pro HLA typizaci jsou DNA arrays, které nacházejí uplatnění také v jiných oblastech molekulární biologie. Principem PCR-SSP systémů je allelově-specifická PCR, kde dochází k amplifikaci sekvencí obsažených v polymorfních oblastech konkrétních alel nebo skupin alel, definující sérologický antigen. Specificita PCR-SSP reakce se zakládá na 3´-komplementaritě dvojíce primerů (sense a antisense) s cílovou DNA sekvencí. Protože enzym Taq polymeráza, který se do reakce přidává, funguje jen v případě, že jsou navázány 3´-komplementární primery, amplifikována je jen cílová DNA, která je současně komplementární oběma primerům. Přítomnost nebo absence amplifikace se detekuje elektroforeticky za využití ethidium bromidu. Každá SSP reakce obsahuje také primery, které amplifikují tzv. „housekeeping“ geny za účelem detekce případné inhibice PCR reakce (pozitivní kontrola). Na rozdíl od PCR-SSP, PCR-SSOP typizace je založená na počáteční amplifikaci všech HLA alel určitého lokusu a následného zachycení PCR produktu sekvenčně-specifickou sondou. Sondy jsou značené digoxigeninem a hybridizace sond s komplementární sekvencí DNA je detekována přidáním protilátky proti digoxigeninu, značenou alkalickou fosfatázou. Metodiky PCR-SSP a PCR-SSOP mají každá své výhody a nevýhody a proto většina typizačních laboratoří ve světě využívá kombinaci těchto dvou metod.

 

Detekce allospecifických protilátek

Významným rizikem pro úspěch transplantace je přítomnost allospecifických protilátek v séru příjemce orgánu. Z tohoto důvodu se před každou transplantací provádí tvz. „cross-match“, t.j. inkubace dárcovských lymfocytů se sérem příjemce. jedná se o lymfocytotoxický test – lýza lymfocytů v přítomnosti králičího komplementu vyvolá barevnou reakci a tato pozitivita reakce je kontraindikací orgánové transplantace (riziko hyperakutní rejekce). V současnosti nabývají na významu modernější metody FACS cross-match a ELISA s větší citlivostí. U potenciálních příjemců orgánu na tvz. „waiting listu“ je screening alloreaktivních protilátek proti buněčnému panelu prováděn 4 x ročně.

 

Další informace

Transplantační imunologie

 

Ilja Stříž

 

Poslední aktualizace: 2006-12-01