SEKK - Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi 2012

OSN-SAbstraktOSN-E

Analytická metoda, která pomocí imunochemické reakce s enzymatickou detekcí umožňuje stanovit v neznámém vzorku koncentraci analytu. Je analogií radioisaturační analýzy (RSA), kde radioizotop je nahrazen enzymem s vysokým číslem přeměny.

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

RIA IRMA

 

OSN-STextOSN-E

EIA lze rozdělit na heterogenní (vyžadující separaci volné a vázané frakce analytu) a homogenní (nevyžadující tuto separaci). Heterogenní EIA mohou být kompetitivní a nekompetitivní

 

HETEROGENNÍ                                  HOMOGENNÍ

 

Kompetitivní                                       -pro stanovení malých molekul

-se značeným antigenem                    -pro stanovení makromolekul

-se značenou protilátkou

 

Nekompetitivní

-se značenou protilátkou

 

Indikátorem imunoanalytické metody je enzymový konjugát. Podle povahy substrátu je reakci možno detekovat spektrofotometricky, nefelometricky, fluorometricky, luminometricky.

 

-         Heterogenní kompetitivní se značeným antigenem

 Soutěživá reakce mezi analytem a analytem označeným enzymem (konjugátem) o vazebná místa na protilátce (analogie s RIA). Po separaci volné a na protilátku vázané frakce proběhne detekční enzymatická reakce. Změřením koncentrace vzniklého produktu (nebo úbytku substrátu) lze stanovit hladinu analytu. Kalibrační závislost je nelineární (ke kalibraci je třeba použít dostatečný počet kalibračních bodů). Odezvový signál může být přímo, ale také nepřímo úměrný koncentraci analytu (záleží na tom, zda se měří volná nebo vázaná frakce a rovněž záleží na povaze substrátu).

 

-         Heterogenní kompetitivní se značenou protilátkou

 V tomto případě musí být antigen navázán na pevnou fázi. Při  kompetitivní reakci s antigenem v neznámém vzorku se ustaví rovnováha. Nenavázaný konjugát je odstraněn z reakční směsi promytím a konjugát vázaný na pevné fázi je inkubován s enzymovým substrátem. Je možné měřit i volnou frakci nenavázaného konjugátu. Kalibrace je nelineární, její charakter závisí na zvoleném typu reakce a charakteru substrátu. Detekce může být fotometrická, fluorometrická i luminometrická podle typu substrátu.

 

-         Heterogenní nekompetitivní enzymoimunoanalýza

 Obvykle se používá dvojice protilátek proti dvěma různým antigenním determinantám analytu (analogie IRMA). Na jednu z protilátek je kovalentně navázán enzym. Druhá protilátka bývá navázána na pevnou fázi. Po ustavení rovnováhy se vytváří "sandwich" a následuje odstranění nenavázaného konjugátu. Po přidání substrátu je výsledný produkt kvantifikován. Kalibrace je nelineární v celém rozsahu (nutno použít dostatečný počet kalibračních bodů). Podle toho, kterou frakci konjugátu použijeme k měření a o jaký substrát se jedná, je koncentrace analytu přímo nebo nepřímo úměrná odezvovému signálu (fotometrie, luminometrie, fluorometrie). Metoda není sice univerzálně použitelná (vyžaduje analyt se dvěma odlišnými antigenními determinantami), ale už z teoretického principu je citlivější a specifičtější než metody kompetitivní.

 

 

 

-         Homogenní enzymoimunoanalýza

 Snaha o co nejjednodušší EIA vedla k eliminaci separace volné a vázané frakce indikátoru (konjugátu enzym-analyt).V některých případech je při tvorbě konjugátu možno analyt vázat do těsné blízkosti aktivního centra enzymu. Po vytvoření komplexu konjugát-protilátka, může dojít ke stérickému zastínění aktivního centra enzymu a tím k zeslabení jeho enzymové aktivity. Výjimečně se některé enzymy chovají i opačně (zvyšují svou enzymovou aktivitu). V každém případě po proběhlé imunochemické reakci (vazba protilátky s analytem) je modulována (pozměněna) enzymová aktivita konjugátu. To dovoluje vynechat separaci volné a vázané frakce konjugátu a po ustavení rovnovážného stavu imunochemické reakce přidat do původní reakční směsi substrát přímo a měřit odezvový signál (fotometrie, fluorometrie). Homogenní EIA jsou velmi jednoduché z hlediska provedení, jsou však méně citlivé. Používají se ke stanovení především nízkomolekulárních látek (léků, drog), které se jsou v tělních tekutinách v poměrně vysokých koncentracích.

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

Pro enzymoimunoanalýzu (EIA) se velmi často v literatuře používá výraz ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay). ELISA je však speciálním druhem EIA (heterogenní nekompetitivní EIA nebo kompetitivní heterogenní EIA). Další nepřesností je řazení některých EIA mezi FIA a LIA, i když indikátorem je enzym vázán na protilátku nebo antigen a k detekci se používá fluorogenní nebo lumunující substrát.

 

OSN-SAppendixyOSN-E

V imunoanalýze byly enzymy poprvé aplikovány v roce 1971 Engvalem, Perlmannem, Van Weemanem a Schuursem.

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

B. Rothfeld: Nuclear Medicine in vitro. Lippicott Co. 1983

 Zichová, Hušák, Šafarčík: Vyšetřovací metody in vitro v nukleární medicíně. IPVZ Brno, 1993

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Autor: Šafarčík Kristian  

Datum aktualizace: 26. 1. 1998

 

Poslední aktualizace: 2002-01-24