SEKK - Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi 2012

OSN-SAbstraktOSN-E

Fotometrická reakce je nejrozšířenějším způsobem analýzy v klinické chemii, fotometrické detektory patří do základní výbavy mnoha speciálních analytických technik. Pro rutinní měření se používají fotometry filtrové, hodnocení absorpčních spekter v určitých rozsazích vlnových délek umožňují spektrofotometry.

 

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Spektroskopie

 

OSN-STextOSN-E

 

Text je členěn podle osnovy:

A.      Princip absorpční elektronové spektroskopie

B.      Lambert-Beerův zákon

C.      Absorpční spektra

D.      Fotometry, spektrofotometry

 

 

A. Princip absorpční elektronové spektroskopie

 

a)       Absorbovaná energie

Chemické látky se liší strukturou molekuly, tedy uspořádáním elektronů a atomových jader. Chemická látka je stabilní při uspořádání s nejnižší energií. Dodáním energie (zářením, nárazem elektronu, prudkým zvýšením teploty apod.) přejde molekula ze základního do tzv. excitovaného stavu, tedy na vyšší energetickou hladinu. Vzdálenosti energetických hladin odpovídají určitému energetickému stavu (stavy valenčních elektronů, vibrační, rotační stavy). Elektronovým přechodům, které vyžadují energii 300 - 1200 kJ/mol odpovídá ultrafialové záření, vibrační přechody vyžadují desítky kJ/mol, což odpovídá infračervenému záření, rotační přechody spotřebují desetiny kJ/mol (mikrovlnná oblast záření).

 

b)      Absorpční elektronová spektra

Podmínkou, aby sledovaná látka absorbovala v ultrafialové nebo viditelné oblasti záření, je přítomnost vazebných p elektronů ve vazebných molekulových orbitalech a nepárových elektronů v nevazebných molekulových orbitalech. Životnost excitované molekuly je velmi krátká (10-8 s), pohlcená energie se často změní v tepelnou, která se absorbuje přítomným rozpouštědlem - nezářivý přechod do základního stavu. Pokud molekula odevzdá získanou energii vyzářením fotonu, vzniká rozptýlené záření. Chromofory jsou atomy, nebo skupiny atomů silně absorbující v UV oblasti, zpravidla obsahují násobné (hlavně dvojné) vazby.

 

c)       Barevnost látek

Absorpce látek v oblasti viditelného záření, tj. v rozsahu vlnových délek 400 - 750 nm, vede k barevnosti látek. Průhledná látka má barvu odpovídající záření, které sama neabsorbuje, barevný roztok absorbuje záření doplňkové barvy (roztok, který se okem jeví jako červený, absorbuje z viditelného světla především barvu modrozelenou, neabsorbuje barvu červenou).

 

 

 

 

B. Lambert-Beerův zákon

Prochází-li světelný paprsek prostředím, které je schopno absorbovat, je intenzita paprsku vstupujícího vyšší než intenzita paprsku prošlého tímto prostředím. Tento jev byl v roce 1729 poprvé formulován P. Bouguerem a později ještě jednou objeven Lambertem.

 

Lze jej vyjádřit rovnicí:                 I = I0 * e-bd

 

 

kde:

I0 - intenzita vstupujícího paprsku

I - intenzita paprsku po průchodu absorbujícím prostředím

d - vzdálenost od místa, kde paprsek vstupuje do absorbujícího prostředí

b - absorpční (napierovský) koeficient

 

Převedením vztahu na dekadické logaritmy:

 

            log I/ I0 = log T = -a * d

 

kde:

T - transmitance (propustnost)

a - absorpční koeficient (lineární)

 

V r. 1852 ukázal Beer, že u mnoha roztoků vzniklých rozpuštěním látek, jež absorbují světlo, je koeficient a přímo úměrný koncentraci c rozpuštěné látky. Spojením Lambertova vztahu a Beerových poznatků je popsán základní vztah pro spektrofotometrické metody chemické analýzy, Lambert-Beerův zákon platný pro monochromatické světlo:

 

            A = ε  * c * d = -log T = log I0/I

 

kde:

A - absorbance

c - koncentrace rozpuštěné látky

d - tloušťka absorbující vrstvy

ε  - molární absorpční koeficient

 

 

Charakteristika ultrafialových (UV), viditelných (VIS) a blízkých infračervených (IČ) spekter

 

Lambda (nm)

oblast

barva absorbovaného světla

<380

ultrafialová

neviditelná

380 – 440

viditelná

fialová

440 – 500

viditelná

modrá

500 – 580

viditelná

zelená

580 – 600

viditelná

žlutá

600 – 620

viditelná

oranžová

620 – 750

viditelná

červená

750 – 2000

blízká IČ

neviditelná UV - blízká

220 - 380 nm

daleká

< 220 nm

 

 

Spektrofotometrická nomenklatura

 

Název

Symbol

Definice

Absorbance

A

-log T = log I0/I

Absorpční koeficient

a

A/d * c (c v g/l)

(absorptivita)

Molární absorpční koeficient

ε

A/d * c (c v mol/l)

(molární absorptivita)

Délka dráhy paprsku

d

tloušťka vrstvy (kyvety)

Transmitance

T

I / I0

Jednotka vlnové délky

nm

10-9 m

Absorpční maximum

λmax

vlnová délka při maximální absorpci světla

 

 

C. Absorpční spektra

Na absorpčních křivkách se vyhodnocuje přítomnost maxim, jejich intenzita, počet minim, inflexních a izobestických bodů.

 

Změny v absorpčních spektrech

Vlivem chemických změn např. zavedením další charakteristické skupiny do molekuly nebo změnou použitého rozpouštědla nastává posun absorpčního maxima:

 

-          posun se změnou vlnové délky absorpčního maxima

  1. batochromní posun - vodorovně s osou vlnových délek směrem k vyšší vlnové délce maxima
  2. hypsochromní - při snižování vlnové délky maxima

 

 

 

-          posun se změnou intenzity absorpčního maxima (tj. změnou molárního absorpčního koeficientu)

  1. hyperchromní posun je provázen zvýšením intenzity maxima absorpčního pásu
  2. hypochromní posunutí je provázeno poklesem absorpce

 

 

Izobestický bod

Izobestický bod odpovídá jedné vlnové délce na absorpčních křivkách acidobazických indikátorů představuje vzájemný přechod mezi protonovou a neprotonovou formou v závislosti na pH, v tomto bodě je molární absorpční koeficient pro obě formy stejný.

 

 

D. Fotometry, spektrofotometry

 

Typy fotometrů a jejich základní komponenty

 

jednopaprskové:

-          zdroj světla

-          vstupní štěrbina

-          monochromátor

-          výstupní štěrbina

-          kyveta

-          detektor

 

dvoupaprskové:

-          zdroj světla

-          zrcadlem rozdělení paprsku na dva rovnoběžné

-          dvě vstupní štěrbiny

-          dva monochromátory

-          dvě výstupní štěrbiny

-          dvě paralelní kyvety (vzorková + srovnávací)

-          dva detektory zdroj světla

-          vstupní štěrbina

-          monochromátor

-          výstupní štěrbina

-          hranolem a soustavou zrcadel vymezení dvou rovnoběžných paprsků

-          dvě paralelní kyvety (vzorková + srovnávací)

-          oba paprsky soustředěny soustavou zrcadel do jednoho místa, kde se intenzity vzájemně odečtou

-          detekce výsledného signálu jedním detektorem

 

 

Zdroje světla:

-          výbojky (vodíková, deuteriová, xenonová) - pro blízkou ultrafialovou (UV) oblast,

-          žárovky - žhavená wolframová spirála - pro viditelnou (VIS) a infračervenou (IČ) oblast,

-          spektrální lampy (monochromatické záření) - rtuťová výbojka, křemenné halogenové lampy.

 

Monochromátor:

-          vstupní štěrbina

-          disperzní prvek

-          zaostřovací soustava

-          výstupní štěrbina

 

Monochromatické záření je elektromagnetické záření velmi úzkého oboru kmitočtů (vlnových délek). Monochromátory jsou optická zařízení jimiž se ze spektra mechanicky vymezí jeho určitá část. Disperzním prvkem v monochromátoru je hranol nebo mřížka. Vymezení úzkého pásu monochromatického záření je dáno výstupní štěrbinou, požadovaná vlnová délka se nastavuje přímým otáčením disperzního prvku. Nejvyšší kvalita monochromatického záření se definuje jako "efektivní spektrální šířka pásu".

 

Možnost plynulé změny vymezení monochromatického záření je využívána pro snímání spekter, přístroje tohoto typu jsou nazývány spektrofotometry.

 

Filtry:

Vymezují ze spojitého záření nejužší pás monochromatického záření:

-          barevné - vrstvička oxidu kovu na skleněné podložce nebo želatinová vrstva vybarvená organickým barvivem,

-          interferenční - využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi mezními plochami s dobrými odrazovými vlastnostmi.

 

Charakteristiku filtru dává jeho křivka propustnosti, pološířka odpovídá intervalu vlnových délek při poloviční propustnosti filtru. Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr lepší. Přístroje s vyměnitelnými filtry jsou určeny pro měření při vybraných oblastech vlnových délek, slouží pro rutinní měření, jsou nazývány fotometry.

 

Kyvety:

Pro fotometrická měření se používají kyvety skleněné a plastové (pro viditelnou oblast spektra) nebo křemenné pro měření v ultrafialové oblasti. Tloušťka kyvety bývá obvykle 1 cm (při manuálním měření, analyzátory s fotometrickou detekcí používají kyvety menších rozměrů), běžné je i používání průtokových kyvet a průtokových cel.

 

Detekce:

Fotometrická detekce je založena nejčastěji na fotoelektrickém efektu, kdy energie záření se přeměňuje na měřitelnou elektrickou energii:

a)       hradlový článek,

b)       fotonásobič,

c)       fotodiodové pole.

 

Požadavky na laboratorní fotometr:

-          minimální měřené objemy,

-          end point reakce,

-          kinetické měření,

-          lineární, nelineární kalibrace,

-          programovatelnost a uložení parametrů metod,

-          automatické podavače pro sériové analýzy,

-          automatické zpracování dat,

-          komunikace s počítačovou sítí.

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová

 

Poslední aktualizace: 2004-10-18